百螢Annexin V-mFluor Violet 540標(biāo)記實驗方案

一、百螢annexin v-mfluorviolet 540標(biāo)記概述
百螢annexin v-mfluorviolet 540標(biāo)記探針用于檢測細胞功能的探針膜聯(lián)蛋白是在鈣存在下與磷脂膜結(jié)合的蛋白質(zhì)家族。annexin v 是研究細胞凋亡的重要工具。它用作檢測在細胞表面表達磷脂酰絲酸的細胞的探針，這是在細胞凋亡和其他形式的細胞死亡中發(fā)現(xiàn)的特征。有多種參數(shù)可用于監(jiān)測細胞活力。annexin v 染料偶聯(lián)物廣泛用于通過測量磷脂酰絲酸 (ps) 的易位來監(jiān)測細胞凋亡。在細胞凋亡中，ps 被轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜的外層。細胞表面磷脂酰絲酸的出現(xiàn)是細胞凋亡初期/中期的普遍指標(biāo)，可以在觀察到形態(tài)學(xué)變化之前檢測到。這種熒光膜聯(lián)蛋白 v 結(jié)合物具有類似于 pacific orange?（pacific orange? 是 invitrogen 的商標(biāo)）的光譜特性。橙色熒光染色在 405 nm 的紫色激光下很好地激發(fā)，并在 ~560 nm 發(fā)出強烈的藍色熒光。
二、百螢annexin v-mfluorviolet 540實驗方案
分析方案
概述
用測試化合物（200μl/樣品）制備細胞
添加annexin v結(jié)合物測定溶液
室溫孵育30-60分鐘
用流式細胞儀或熒光顯微鏡分析
1.用膜聯(lián)蛋白v綴合物制備和孵育細胞：
1.1制備膜聯(lián)蛋白v結(jié)合測定緩沖液：10mm hepes，140mm l和2.5mm cacl2，ph 7.4。
1.2用測試化合物處理細胞一段所需的時間（用星形孢菌素處理的jurkat細胞4-6小時）以誘導(dǎo)細胞凋亡。
1.3離心細胞，得到1-5×105個細胞/管。
1.4將細胞重懸于200μl膜聯(lián)蛋白v結(jié)合測定緩沖液中（來自步驟1.1）。
1.5在細胞中加入2μl膜聯(lián)蛋白v結(jié)合物。
可選：在細胞內(nèi)加入死細胞染色劑如碘化丙錠，用于壞死細胞。
1.6在室溫下孵育30至60分鐘，避光。
1.7在用流式細胞儀或熒光顯微鏡分析細胞之前，加入300μl膜聯(lián)蛋白v結(jié)合測定緩沖液（來自步驟1.1）以增加體積（參見下面的步驟1.8）。
1.8使用流式細胞儀或熒光顯微鏡監(jiān)測熒光強度（參見下面的步驟2或3）。
2.使用流式細胞儀分析：
通過使用具有適當(dāng)過濾器的流式細胞儀來量化膜聯(lián)蛋白v綴合物。
注意：粘附細胞上的膜聯(lián)蛋白v結(jié)合流式細胞術(shù)分析未經(jīng)常檢測，因為在細胞分離或收獲期間可能發(fā)生特定的膜損傷。 然而，casiola-rosen等人先前報道了利用膜聯(lián)蛋白v對貼壁細胞類型進行流式細胞術(shù)的方法。 和van engelend等人（見參考文獻1和2）。
3.使用熒光顯微鏡分析：
3.1移取步驟1.6的細胞懸液，用膜聯(lián)蛋白v結(jié)合測定緩沖液（來自步驟1.1）沖洗1-2次，然后用膜聯(lián)蛋白v結(jié)合測定緩沖液（來自步驟1.1）重懸細胞。 將細胞添加到蓋有玻璃蓋玻片的載玻片上。
注意：對于粘附細胞，建議直接在蓋玻片上生長細胞。 與膜聯(lián)蛋白v綴合物孵育（步驟1.6）后，用膜聯(lián)蛋白v結(jié)合測定緩沖液（來自步驟1.1）沖洗1-2次，并將膜聯(lián)蛋白v結(jié)合測定緩沖液（來自步驟1.1）加回到蓋玻片中。 在玻璃載玻片上翻轉(zhuǎn)蓋玻片并觀察細胞。 在與膜聯(lián)蛋白v綴合物孵育后，細胞也可以在2％甲醛中固定，并在顯微鏡下觀察。
3.2在熒光顯微鏡下用適當(dāng)?shù)臑V光片分析膜聯(lián)蛋白v綴合物的凋亡細胞
三、百螢annexin v-mfluorviolet 540標(biāo)記光譜特性
吸光度（納米）
401
校正因子（260nm）
1.326
校正因子（280nm）
0.543
消光系數(shù)（cm-1m-1）
180001
激發(fā)（納米）
402
**（納米）
535
產(chǎn)率
0.211
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