英瀚斯(圖)-細胞增殖實驗-湖南細胞

mtt檢測
mtt 是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活xi胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性 mtt 還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（formazan）并沉積在細胞中，湖南細胞，而死細胞無此功能。二jia基亞砜（dmso）能溶解細胞中的甲瓚，細胞融合實驗報告，用酶聯(lián)免yi檢測儀在 570nm 波長處測定其光吸收值，可間接反映活xi胞數(shù)量。
軟瓊脂培養(yǎng)克l隆形成試驗基本步驟:
(1)取對數(shù)生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，細胞增殖實驗，使之成為單細胞，作活l細胞計數(shù)，用含20%胎牛血l清的dmem培養(yǎng)液調整細胞密度至1x106細胞/l。然后根據(jù)實驗要求作梯度倍數(shù)稀釋。
(2)用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個濃度的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40日中不會凝固。
(3)按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2xdmem培養(yǎng)基(含有2x和20%的小牛血l清)混合后，取3ml混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7~ 10ml)，冷卻凝固，可作底層瓊脂置co2溫箱中備用。
(4)按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2xdmem培養(yǎng)基在無菌試管中相混以后，再向管中加入0.2ml的細胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37回5%co2溫箱中培養(yǎng)10~14天。
(5)把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細胞數(shù)。計算形成率。軟瓊脂培養(yǎng)法常用檢測腫l瘤細胞和轉化細胞系。試驗中瓊脂與細胞相混時，瓊脂溫度不宜超過40日。接種細胞的密度每平方厘米不超過35個，一般6cm的平皿接種1000個細胞。正常細胞在懸浮狀態(tài)下不能增殖，不適用于軟瓊脂克l隆形成試驗。
軟瓊脂集落形成率實驗(軟瓊脂克l隆)
將1.2%低熔點瓊脂糖與2x細胞培養(yǎng)基以1:1的體積比混合制備0.6%的底層瓊脂，細胞生物學實驗，6孔板中每個孔1.4ml溫室凝固，取對數(shù)期細胞，胰酶消化后吹散成單個細胞懸液，計數(shù)，并調細胞濃度為10000個/ml，將0.6%低熔點瓊脂糖與2x細胞培養(yǎng)基以1:1的體積比混合，制備0.3%的上層瓊脂，每孔加1ml 上層瓊脂和100ul單細胞懸液(約1000ell/wel)， 混勻，室溫凝固。置于37目，5%co2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周，計數(shù)含50個細胞以上得克l隆，計算細胞集落形成率，spotll 采集圖像。
透射電鏡觀察自噬小體方法
利用光學顯微鏡，借助相應的染色方法，可以觀察細胞凋亡時會出現(xiàn)的一系列形態(tài)特征。常用的染色法包括臺盼藍、橙 / 化乙啶（ao/eb）、giemsa 和 he 法等。在光學顯微鏡下可以觀察到核固縮、質濃縮和凋亡小體等典型的凋亡現(xiàn)象。
電鏡形態(tài)學觀察法是一種比較經(jīng)典、可靠的方法，被認為是確定細胞凋亡的金標準。電鏡下凋亡細胞表現(xiàn)為染色質凝集、核濃縮、核裂解、胞漿收縮和胞膜具有發(fā)泡現(xiàn)象及凋亡小體出現(xiàn)等。
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